会升级的产品都值得期待｜免疫组库

复杂疾病研究动辄成千上万样本量？

癌症研究也要几百上千？

基因组学样本量逐年上升已成趋势！

在大样本量时代，小样本也可以做的免疫研究显得弥足珍贵。

作为疾病研究的重点，免疫在自身免疫性疾病、感染、炎症等方面应用广泛，尤其在肿瘤治疗领域。

免疫组库以T/B淋巴细胞为突破口，既可为主，用于病程跟踪、疗效监控、疾病诊断的研究；亦可为辅，辅助基因组学和转录组学研究。

此次免疫组库产品升级，又带来了哪些“神应用”？

升级亮点

更丰富的分析结果

新增多种结果统计图表；新增V/J基因频率分布统计、多样品聚类分析、共性分析；新增四种多样性评估指标。

更友好的xbio结题报告展现形式

全新升级的结题报告界面友好，对分析方法及结果解释详尽，图表按照发表文章要求展示，让您一目了然。

更真实的克隆定量信息

将低质量reads与高质量克隆进行比对，挽回部分数据，让克隆定量信息不丢失。

更强的纠错能力和错配处理能力

利用多层聚类方法，纠正PCR和测序引入的错误；错配处理能力提升更适合分析BCR的高突变区域。

部分升级内容展示

图1 克隆群体特征分析

A，V-J基因组合频率Circos图，每个颜色块代表一种基因，颜色块越宽，频率越高。色块间的连线代表一种V-J基因组合方式。B，克隆频率分布，横纵坐标分别为克隆数和克隆频率。C，克隆频率分布甜甜圈图。第一层为1个reads、2个reads及≥3 reads支持的克隆类型比例；第二层为≥3 reads支持的克隆类型中，top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累积频率分布；第三层为top5克隆类型的频率分布及对应的氨基酸序列。D，Top20 V基因频率组间分布柱状图。

案例分享

免疫组库研究方向包括肿瘤、免疫病、感染类疾病、炎症性疾病、移植、抗体研究和一些淋巴细胞相关的基础研究。发表文章呈逐年上升趋势，并且近年来逐渐被用于临床转化研究中。

图2 IR-seq技术历年发表文章统计

（数据来自PubMed，关键词immune repertoire sequencing）

1肿瘤案例

 TCR克隆异质性与新抗原异质性及肺癌复发的关系

Cancer Discov. 2017Oct;7(10):1088-1097.

研究目的：寻找免疫检查点（PD-1、CTLA-4）治疗疗效的biomarker

研究样本：11例未转移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)

研究技术：WES、TCR sequencing

研究结果：病灶特有突变导致新抗原（neoantigen）的内部表达差异，因此，产生不同的免疫原性，形成了TIL克隆内部差异（TCR ITH）。TCR ITH（intratumorheterogeneity）高与术后疾病复发和低生存率有关。

图3 TCR克隆异质性（ITH）与肺腺癌基因组和临床的相关性

（A）年龄与MOI相关性。（B）新抗原与MOI负相关。（C）复发的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）。（D）MOI越高（TCR克隆多样性越低），病人的无病生存期（disease-free survival）越长。MOI：克隆重叠指数，范围0-1，0代表克隆完全不同，1代表克隆完全相同。

2感染类疾病案例

TCRβ序列特征可准确预测CMV感染状态

Nature Genetics. 2017, 49(5): 659-665.

研究目的：确定是否可以用TCR特征预测CMV（巨细胞病毒）感染状态。

研究样本：群体1：共计666个样本，其中289个CMV阳性，352个CMV阴性，40个感染状态未知；群体2：120个验证样本。

研究结果：对289个CMV⁺和352个CMV^-样本进行免疫组库测序，发现了CMV相关的TCRβ序列特征，并且利用TCRβ可以从666个研究样本和120个验证样本中，准确鉴定出CMV感染状态。研究还发现该群体的TCRβ与HLA-A或HLA-B显著相关。

图4 TCRβ可预测CMV感染状态

（a）CMV⁺和CMV^-样本中unique TCRβ分布散点图。（b）ROC曲线显示TCRβ作为CMV感染状态分类器的分类效果。其中虚线表示在群体1中的测试结果，短虚线代表群体1中的交叉验证效果，实线代表群体2中独立验证效果。每条线上的黑圈代表最大后验概率（MAP）的决定阈值。插入图表展示的是群体2中MAP分类效果，敏感度为0.90，特异性为0.89。

3自身免疫性疾病案例

杀伤T细胞的突变积累可能与类风湿性关节炎发病有关

Nature Communication. 2017, 8:15869.

研究目的：大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）常合并发生类风湿性关节炎（RA），研究发现LGL病人的CD8⁺ T细胞克隆存在STAT3突变，而拥有该突变的LGL病人更容易并发RA（43% vs.6%）。因此推测，发生体细胞突变的CD8⁺ T细胞可能与RA发病有关。

研究样本：82例新诊断未治疗的RA病人，20例健康人，取外周血。

研究结果：首次采用CD4⁺ T细胞做对照，过滤生殖系突变（germline mutations），对分选的T细胞进行目标区域测序、外显子测序和TCR β链CDR3测序。发现，大约20%（5/25）病人的CD8⁺ T细胞有体细胞突变（somatic mutations），而CD4⁺ T细胞没有，RNA-seq确认了突变基因在CD8⁺ T细胞中高表达。功能分析发现，这些基因突变与免疫调控、细胞增殖有关，因此推测，发生体细胞突变的CD8⁺ T细胞可能与RA及其他自身免疫性疾病的发病有关。

图4 病人1中CD8⁺ T细胞的克隆分布及突变

（a）利用TCR测序获得的CD8⁺ T细胞克隆分布。（b）病人1中存在两个高频克隆，经过免疫抑制治疗后仍高表达。（c）利用扩增子测序，在流式分选后的亚群中进行突变验证。（d）本文研究思路图。

关于免疫组库

T/B细胞是适应性免疫系统的两大细胞群，细胞表面受体TCR/BCR存在一块区域叫互补决定区（Complementary Determining Region, CDR），包含CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3最高变，在抗原识别中起关键作用。华大的免疫组库测序是通过多重PCR和高通量测序技术，分析编码CDR3区的DNA/RNA序列，获得机体的免疫特征。

服务内容

华大基因已发表IR-seq相关文章

肝癌亚型差异分析 Oncoimmunology. 2015 Apr2;4(8):e1021537.

分析软件IMonitor Genetics. 2015 Oct;201(2):459-72.

实验方法学 PLoS One. 2016 Mar 28;11(3):e0152464.

综述 Cancer Lett. 2016 Sep 1;379(2):206-12.

原发性胆汁性胆管炎 J Immunol. 2016 Sep 1;197(5):1609-20.

微小残留病 Front Immunol. 2016 Oct 4;7:403.

预测V/J基因软件 Front Immunol. 2016 Nov 4;7:457.

乳腺癌、癌旁和淋巴结的TCR分析 Cancer Immunol Res. 2017 Feb;5(2):148-156.

结肠腺瘤和结肠癌浸润淋巴细胞 J Immunol. 2017 May 1;198(9):3719-3728.

撰稿：钟美明

编辑：市场部

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